Endokrynologia Pediatryczna, Tom 8 | Rok 2009 | Nr 1(26)
DOI: 10.18544/EP-01.08.01.1135
Ocena markerów oksydacji białek ( AOPP) i lipidów (TBARs) u dzieci z cukrzycą typu 1
1Katedra i Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Akademii Medycznej we Wrocławiu
2Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu
Słowa kluczowe: cukrzyca typ 1, stres oksydacyjny, zaawansowane produkty peroksydacji białek, substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowymi
Streszczenie
Wstęp. Stres oksydacyjny jest określany jako wzmożone wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), przekraczające wydolność fizjologicznych układów antyoksydacyjnych. Rośnie liczba dowodów potwierdzających udział stresu oksydacyjnego w patogenezie cukrzycy. Celem badania była ocena markerów stresu oksydacyjnego (poziom zaawansowanych produktów oksydacji białek – AOPP, oraz substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym – TBARs) w korelacji z wiekiem pacjentów, długością trwania choroby, wskaźnikami wyrównania metabolicznego (HbA1C, lipidy) u pacjentów z DM1 w okresie rozwojowym. Ponadto podjęto próbę oceny stresu oksydacyjnego u rodzeństwa pacjentów z DM1. Materiał i metody. W badaniu wzięło udział 87 pacjentów z DM1 leczonych w Klinice Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego AM we Wrocławiu oraz 27 dzieci będących rodzeństwem pacjentów z DM1. Grupę kontrolną stanowiło 41 zdrowych dzieci z rodzin nieobciążonych cukrzycą. Wyniki. Stężenie AOPP oraz TBARs u pacjentów z DM1 było istotnie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (AOPP – 103,1 μmol/l vs 56,1 μmol/l; p < 0,0001, TBARs – 1,37 nmol/ml vs 1,28 nmol/ml; p = 0,038). W grupie rodzeństwa pacjentów z DM1 obserwowano tendencję do wyższych wartości AOPP w porównaniu z grupą kontrolną. Poziom AOPP u dzieci z DM1 trwającą < 4 lata różnił się istotnie w porównaniu z cukrzycą trwającą ≥ 4 lata (p < 0,0001) oraz z grupą kontrolną (p = 0,009). Stężenie TBARs w grupie dzieci z DM1 trwającą < 4 lat różniło się istotnie w porównaniu z grupą, w której DM1 trwała ≥ 4 lata. W grupie chorujących krócej stwierdzono istotnie niższe wartości TBARs (p < 0,0001), nieróżniące się od wartości u dzieci z grupy kontrolnej. Stężenie AOPP było niższe w grupie z HbA1C < 8% w porównaniu z grupą z HbA1C ≥ 8% (p = 0,045), ale istotnie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,0001). Podobnie poziom TBARs u osób z HbA1C < 8% był istotnie niższy w porównaniu z wartością u dzieci z HbA1C ≥ 8% (p = 0,001), nie wykazując różnicy w porównaniu z grupą kontrolną. Wnioski. 1. W DM1 obserwuje się nasilony proces peroksydacji lipidów, a stopień jego nasilenia jest większy w cukrzycy źle kontrolowanej. 2. U pacjentów z DM1 niezależnie od stopnia wyrównania metabolicznego wzrasta kumulacja końcowych produktów oksydacji białek, a proces nasila się wraz z czasem trwania choroby. 3. Na zaburzony status antyoksydacyjny mogą wpływać inne czynniki poza cukrzycą, za czym przemawiają wyniki badań u rodzeństwa pacjentów z DM1.
Wstęp
Przyczyną cukrzycy typu 1 (DM1) jest postępujące uszkodzenie komórek β wysp trzustki, prowadzące do całkowitej utraty źródła insuliny w organizmie [1]. W patogenezie autodestrukcji komórek β biorą udział makrofagi, limfocyty T cytotoksyczne/supresorowe, komórki dendrytyczne, limfocyty T pomocnicze oraz wydzielane przez nie mediatory: cytokiny, reaktywne formy tlenu (ROS), enzymy cytolityczne [2]. Komórki β są szczególnie podatne na uszkodzenia wywołane działaniem ROS. Potwierdzeniem tego są obserwacje na zwierzęcych modelach cukrzycy, wywołanej streptozotocyną lub alloksanem, w których wykazano, że nadmierna produkcja ROS była czynnikiem niszczącym komórki β. Badania innych autorów nie wskazują jednoznacznie, czy generacja ROS jest bezpośrednią przyczyną śmierci komórek β, czy też konsekwencją progresji choroby [3, 4]. Ostatnio, sugeruje się, że wzrost mitochondrialnej produkcji ROS występujący w stanach hiperglikemii może odpowiadać za większość patologii w cukrzycy. Wolne rodniki tlenowe powstają również pod wpływem promie-
niowania jonizującego i nadfioletowego oraz działania ultradźwięków, a także w procesach oddychania komórkowego i szeregu reakcji enzymatycznych. Istotnym ich źródłem jest autooksydacja zredukowanych związków niskocząsteczkowych, tj. glukozy, związków tiolowych (np. cysteina, glutation), katecholamin, flawin, hydrochinonów [5].
Mechanizm toksyczności wielu ksenobiotyków, substancji obcych dla organizmu, a będących składnikami pożywienia, a także leków i związków zanieczyszczających środowisko (pestycydy), również wiąże się z nadmierną produkcją ROS [5]. Do czterech najbardziej toksycznych – reaktywnych formy tlenu (ROS) należą: anionorodnik ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru, rodnik hydroksylowy
oraz tlen singletowy [6]. Stan w którym dochodzi do wzmożonego wytwarzania ROS, przekraczający wydolność fizjologicznych układów antyoksydacyjnych jest określany stresem oksydacyjnym [7]. W warunkach stresu oksydacyjnego ujawnia się uszkadzające działanie ROS wobec związków organicznych, głównie lipidów i białek, a konsekwencją tego działania są zaburzenia strukturalne i czynnościowe na poziomie molekularnym i komórkowym. Obecnie istnieje wiele badań potwierdzających udział stresu oksydacyjnego w patogenezie różnych schorzeń narządowych [8, 9]. Wytworzone w nadmiarze ROS wykazują uszkadzające działanie na składniki komórek (białka, lipidy, DNA), zaburzając ich prawidłową funkcję [10, 11, 12].
ROS poprzez oksydację grupy tiolowej mogą bezpośrednio aktywować wszystkie cząsteczki zawierające grupy sulfhydrylowe, takie jak białka czy glutation (GSH), a poprzez utlenianie białek, kwasów nukleinowych i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych reagować ze wszystkimi głównymi składnikami komórek [13]. Najbardziej znanym procesem wolnorodnikowym jest peroksydacja lipidów, w którym utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych przebiega z powstawaniem nadtlenków tych związków. Peroksydacja lipidów jest procesem nieenzymatycznym, który po raz pierwszy został zdefiniowany przez Fappela [8]. W warunkach fizjologicznych jest kontrolowana przez mechanizmy antyoksydacyjne, a zwłaszcza przez układ enzymatyczny związany z SeGSH-Px (selenozależna peroksydaza glutationowa) [14, 15]. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe dzięki swej strukturze łatwo wchodzą w reakcje z ROS. Szczególnie niebezpieczna jest produkcja aldehydów, takich jak hydroksyaldehyd dwumalonowy (MDA), który jest najbardziej znanym, choć nieswoistym markerem peroksydacji lipidów. Jest on wykładnikiem laboratoryjnym stresu oksydacyjnego w reakcji z kwasem tiobarbiturowym [8, 16–18]. W reakcję z kwasem barbiturowym oprócz MDA wchodzą związki, które określa się jako „substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowym” (TBARs) [19]. MDA wchodzi w reakcję z aminokwasami białek strukturalnych i enzymatycznych, czego następstwem jest polimeryzacja elementów błon komórkowych, powodująca ich usztywnienie, rozprzęganie transportu przezbłonowego, zmiany kanałów błonowych, modyfikacja aktywności enzymów związanych z błonami, a także zmiana ich charakteru antygenowego [9]. Na uwagę zasługuje łatwość połączeń MDA z kolagenem i elastyną, co u chorych z cukrzycą wiąże się ze sztywnieniem ścian naczyń [18].
Łatwo utleniane przez ROS są krążące we krwi LDL, szczególnie nienasycone kwasy tłuszczowe triacylogliceroli i estrów cholesterolu. Utlenione LDL (oxLDL – oxidized low-density lipoproteid) poprzez wpływ na cykl komórkowy prowadzą do dysfunkcji endotelium, czego wynikiem jest zarówno proliferacja i hiperplazja komórki, jak i ich apoptoza. Makrofagi wychwytują oxLDL przekształcając się w komórki piankowate, stanowiące podstawowy element wczesnych zmian miażdżycowych [20, 21].
Wynikiem oksydacyjnych uszkodzeń białek jest modyfikacja grup prostetycznych w białkach, modyfikacja reszt aminokwasowych oraz agregacja lub fragmentacja cząsteczek białkowych [22]. Działanie ROS na białka dotyczy uszkadzającego działania kilku reszt aminokwasowych, w tym histydyny, proliny, argininy i lizyny, prowadząc do wytworzeniem grup karbonylowych. Uszkodzenie oksydacyjne białek prowadzi do szybkiej utraty ich aktywności biologicznej. Ma to znaczenie w procesie starzenia, a także w stanach patologicznych, takich jak cukrzyca, miażdżyca czy schorzenia neurodegeneracyjne [9]. Laboratoryjnymi markerami oksydacyjnych uszkodzeń białek są: nitrotyrozyna [22, 23], sulfoksyd metioniny (MetSO) i N-formylokinurenina (NFK) [2] oraz stężenie końcowych produktów oksydacji białek (AOPP) [24]. Należy zaznaczyć, że peroksydacja białek i kwasów nukleinowych nie ma charakteru łańcuchowego, tak jak w przypadku lipidów. Oksydowane białka i kwasy nukleinowe częściej wchodzą w reakcję z niskocząsteczkowymi antyoksydantami, obniżając pulę tych związków [5].
Cel pracy
Ocena poziomu zaawansowanych produktów oksydacji białek (AOPP), substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARs), jako markera peroksydacji lipidów. Wykazanie zależności pomiędzy poziomem stresu oksydacyjnego a wiekiem pacjentów, długością trwania choroby, wskaźnikami wyrównania metabolicznego (HbA1c, lipidy). Ocena zachowania się markerów stresu oksydacyjnego u rodzeństwa pacjentów z DM1.
Materiał i metody
Badaniami objęto 155 dzieci i młodzieży, których podzielono na trzy grupy. Grupa I – 87 pacjentów z DM1 (49 chłopców i 38 dziewczynek) w wieku od 2 do 19 lat (średnio 13,0+4,0), leczonych w Klinice Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego AM we Wrocławiu średnio od roku do 13 lat. Grupa II – 27 dzieci, będących rodzeństwem pacjentów z DM1 (11 chłopców i 16 dziewczynek), w wieku od 4,5 do 16,5 lat
(średnio 13,2+3,7), grupa III kontrolna – 41 zdrowych dzieci z rodzin nieobciążonych cukrzycą (19 chłopców i 22 dziewczynki), w wieku od 10,5 do 18 lat (średnio14,8+2,2).
U pacjentów z DMT1 nie stwierdzono późnych powikłań choroby. Dzieci z DM1 w zależności od stopnia wyrównania metabolicznego podzielono na dwie podgrupy: I a – pacjenci z HbA1C ≥ 8%, II a – pacjenci z HbA1C < 8%. Charakterystykę dzieci z DMT1 przedstawiono w tabeli 1 i 2. Na wykonanie badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej we Wrocławiu. Analizowane parametry były oznaczane w surowicy. Krew pobierano rano na czczo, przy okazji rutynowych badań laboratoryjnych z żyły łokciowej. HbA1C oznaczano metodą immunoinhibicyjną za pomocą analizatorów OLYMPUS (Olympus Diagnostica GmbH) z użyciem odczynników tej samej firmy. Zakresy odniesienia: 4,0 – 6,2%. Lipidy w surowicy – stężenia cholesterolu całkowitego, trójglicerydów, frakcji LDL i HDL cholesterolu oznaczano metodami enzymatycznymi za pomocą zestawów firmy BioSystems SA. Wyniki stężenia cholesterolu i trójglicerydów interpretowano wg norm przyjętych dla wieku rozwojowego przez Thompsona i wsp.: dla cholesterolu całkowitego < 200 mg%, dla trójglicerydów < 130 mg% [25]. Stężenie zaawansowanych produktów oksydacji białek (AOPP) w surowicy krwi oznaczano metodą Witko-Sarsat [26]. Krzywa kalibracji została sporządzona z chloraminą w zakresie stężeń: 0-100 μmol/L. Stężenie AOPP w badanej surowicy zostało
wyrażone w μmol/L równoważnika chloraminy.
Stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARs) w surowicy krwi oznaczano zmodyfikowaną metodą Rice-Evans [27]. Stężenie TBARs zostało obliczone za pomocą milimolowego współczynnika absorpcji równego 156 mM-1 cm-1 i wyrażone w nmol/ml.
Analizę rozkładu badanych parametrów przeprowadzono testem normalności D’Agostino-Pearson. Dla zmiennych z rozkładem normalnym podano wartości średnie (TBARs), natomiast w przypadku braku rozkładu normalnego wyniki przedstawiono jako mediany (AOPP). Badane grupy porównywano z uwzględnieniem ich rozkładu i liczebności. Dla zmiennych z rozkładem normalnym użyto testów parametrycznych: ANOVA – do oceny średnich w wielu grupach, t-testu – do porównania średnich między dwiema grupami i testu Pearsona 2 do analizy korelacji. Dla oceny zmiennych nieposiadających rozkładu normalnego użyto testów nieparametrycznych: Kruskal-Wallisa – do porównania
median w wielu grupach, Manna-Whitneya – do porównania median w dwóch grupach i testu rang Spearmana – do analizy korelacji. Analizę częstości przeprowadzono testem chi-kwadrat. Wartości średnich i median przedstawiono razem z ich 95% przedziałem ufności. Dla wszystkich analiz statystycznych istotność statystyczną określono dla p < 0,05.
Diagnostyczną przydatność markerów stresu oksydacyjnego (AOPP, TBARs) określono za pomocą ROC analizy. Całościowe przedstawienie
analizowanych wskaźników zostało wyrażone wymiarem pola pod krzywą ROC, razem z 95% przedziałem istotności i znamiennością statystyczną dla różnicy między obliczonym polem pod krzywą a polem równym 0,5. ROC analiza została także zastosowana celem dychotomizacji zebranych danych i obliczenia czułości i specyficzności testu dla optymalnej wartości odcięcia (cut-off). W celu porównawczych wartości czułości i specyficzności podsumowano wyznaczając współczynnik Youndena (czułość + specyficzność-1). Szacowano również wskaźniki prawdopodobieństwa wyników dodatnich i ujemnych. Markery stresu oksydacyjnego były rozpatrywane w dwóch kategoriach – jako potencjalne wskaźniki obecności choroby oraz jako markery wyrównania metabolicznego. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu komputerowego MedCalc Version 9.2.1.0 software.
Wyniki badań
Stężenie AOPP i TBARs w grupie pacjentów z DM1 było IS wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0001 vs p = 0,032) – tabela III, ryc. 1.
U chorych z DM1 wykazano dodatnią IS korelację pomiędzy stężeniem AOPP a TBARs (r = 0,320, p = 0,003), natomiast w grupie rodzeństwa korelacja była na granicy IS (r = 0,37, p = 0,058) – tabela IV.
Poziom AOPP korelował dodatnio z czasem trwania choroby oraz z HbA1C, natomiast stężenie TBARs z płcią, wiekiem pacjentów, BMI, czasem trwania choroby i HbA1C. Poziom HbA1C korelował dodatnio z wiekiem pacjentów i czasem trwania choroby – tabela V.
Najwyższy poziom AOPP oraz TBARs wykazano u dzieciu z HbA1c > 8%. Różnił się on IS od grupy dzieci z HbA1c < 8% oraz dzieci zdrowych – ryc. 2, tabela VI.
Stężenie AOPP oraz TBARs u dzieci z cukrzycą trwającą > 4 lat było IS wyższe w porównaniu z grupą dzieci z cukrzycą trwającą < 4 lat oraz dzieci grupy kontrolnej – ryc. 3.
Spośród analizowanych markerów stresu oksydacyjnego, jedynie stężenie TBARs było IS wyższe u pacjentów, u których poziom cholesterolu był ≥ 200 mg/dl (p = 0,005). Nie wykazano wpływu podwyższonego poziomu trójglicerydów na wartości AOPP, TBARs. Analiza korelacji markerów stresu oksydacyjnego z parametrami gospodarki lipidowej wykazała dodatnią korelację TBARs ze stężeniem cholesterolu całkowitego (r = 0,446; p < 0,001). Wartości HbA1C dodatnio korelowały ze stężeniem TGC (r = 0,288; p = 0,034).
Porównując markery stresu oksydacyjnego i wartość HbA1C w podgrupie chorych z BMI ≥ 90 centyla z podgrupą pacjentów z BMI < 90 centyla dla wieku i płci, wykazano IS wyższe wartości TBARs u pacjentów z BMI > 90 centyla, natomiast stężenie AOPP i HbA1C nie różniły się IS w obu badanych podgrupach.
Analiza wzajemnych powiązań pomiędzy markerami stresu oksydacyjnego a danymi klinicznymi pacjenta wykazały, że jedynie BMI, HbAIC i całkowity cholesterol wywierają niezależny efekt na akumulację TBARs. Tę częstość obliczono na 49% odchylenia dla TBARs (współczynnik determinacji R2 = 0,487; współczynnik wielokrotnej korelacji Rm = 0,698). Na poziom zaawansowanych produktów oksydacji białek (AOPP) wpływało jedynie stężenie HbA1C. Model regresji wyjaśnił nie więcej niż 9% wariancji AOPP (współczynnik determinacji R2 = 0,090; współczynnik wielokrotnej korelacji Rm = 0,300), dlatego wydaje się, że na poziom AOPP u pacjentów z cukrzycą mogły wpływać inne zmienne, które nie były analizowane w tym modelu.
Wykazano, że AOPP może być dobrymi wskaźnikami obecności choroby (dla AOPP czułość 81,6%, specyficzność 82,9%, AUC = 0,855, p = 0,0001; podczas gdy TBARs nie wykazuje takiej właściwości (czułość 73,6%, specyficzność 44,7%, AUC = 0,595, p = 0,086). Zarówno AOPP, jak i TBARs nie są dobrymi wskaźnikami kontroli metabolicznej w cukrzycy wyrażonej stężeniem HbA1C (dla AOPP czułość 80,0%, specyficzność 52,8%, AUC = 0,627, p = 0,035; dla TBARs czułość 48,0%, specyficzność 83,3%, AUC = 0,694, p < 0,001) – tabela VII.
Za pomocą ROC analizy obliczono optymalne wartości progowe dla wszystkich badanych markerów stresu oksydacyjnego. Porównując odsetek podwyższonych wartości TBARs, AOPP w trzech badanych grupach, stwierdzono znacząco większy odsetek podwyższonych wartości AOPP (powyżej 70,8 μmol/L) u rodzeństwa chorych na cukrzycę w porównaniu z grupą kontrolną (56% vs 17%, p = 0,002), natomiast w zakresie TBARs różnica pomiędzy grupą rodzeństwa i grupą kontrolną nie była IS.
Dyskusja
Znaczenie stresu oksydacyjnego w cukrzycy typu 1 i 2 jest tematem wielu badań klinicznych. Dowiedziono, że wzmożona generacja ROS może odgrywać ważną rolę w autodestrukcji komórek β, a także może być jednym z mechanizmów rozwoju przewlekłych powikłań choroby, jak: retinopatii, nefropatii, neuropatii oraz powikłań sercowo-naczyniowych [19]. Hiperglikemia nasila utylizację glukozy w cyklu Krebsa, prowadząc do zwiększonego wycieku anionów ponadtlenkowych z mitochondrialnego łańcucha oddechowego [28]. Reaktywne formy tlenu poprzez indukowanie biochemicznych szlaków przemian (kumulacja produktów glikacji i oksydacji oraz dysfunkcja komórek śródbłonka, pericytów i komórek błony mięśniowej naczyń) prowadzą do rozwoju mikro- i makroangipatii. W powikłaniach tych dochodzi do nasilenia syntezy ROS w mechanizmie niedokrwienia tkanek, dysfunkcji śródbłonka i aktywacji procesów zapalnych [29]. Nasilenie stresu oksydacyjnego powinno dodatnio korelować ze wskaźnikami kontroli metabolicznej cukrzycy i obecnością jej późnych powikłań. Wiele dowodów przemawia za udziałem stresu oksydacyjnego w patogenezie przewlekłych powikłań cukrzycy. Według autorów markery stresu oksydacyjnego mogą być laboratoryjnym dowodem ich obecności [29].
Wykazano, że DM1 jest niezależnym czynnikiem rozwoju miażdżycy i wczesnego wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego [30, 31].
W wielu pracach podejmowane są próby wykorzystania markerów stresu oksydacyjnego jako dodatkowych klinicznych wykładników oceniających wyrównanie metaboliczne cukrzycy oraz określających ryzyko rozwoju mikro- oraz makroangiopatii [10, 32, 33]. Procesem świadczącym o nasileniu stresu oksydacyjnego jest peroksydacja lipidów. Laboratoryjnym parametrem służącym do jego oceny jest stężenie malonylodialdehydu (MDA) lub stężenie końcowych produktów peroksydacji lipidów (MDA, 4-HNE-4-hydroksynonenal), określanych wspólnym mianem „substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym” (TBARs). Większość autorów potwierdza nasiloną produkcję MDA/TBARs u pacjentów z cukrzycą typu 1 [10, 32–34]. U badanych dzieci z DM1 stężenie TBARs było IS wyższe w porównaniu z grupą rodzeństwa oraz z grupą kontrolną. Badania Vander Jagt i wsp. nie wykazały różnicy stężenia TBARs u pacjentów z DM1 w porównaniu z grupą kontrolną, niezależnie od braku czy też obecności powikłań. Autorzy tych badań sugerują, że lepszym markerem oceniającym stres oksydacyjny w cukrzycy może być badanie organicznych nadtlenków, których stężenie u osób z DM1, niezależnie od obecności powikłań naczyniowych, było IS wyższe [35]. W badanej grupie nie stwierdzono późnych powikłań cukrzycy, które według autorów mogą odgrywać znaczącą rolę w powstawaniu produktów peroksydacji lipidów. Autorzy wykazali, że hiperglikemia per se nasila glikację białek, jak również przyspiesza procesy peroksydacji lipidów [3]. W badaniu własnym wykazano IS wyższe stężenie TBARs w grupie pacjentów ze złym wyrównaniem metabolicznym cukrzycy (HbA1C ≥ 8%) w porównaniu z grupą pacjentów, u których HbA1C < 8% oraz z grupą kontrolną. Stężenie TBARs korelowało dodatnio z poziomem HbA1C, BMI oraz stężeniem całkowitego cholesterolu. Wynik jest zgodny z wynikami badań innych autorów, którzy wskazują na wzajemną korelację pomiędzy peroksydacją lipidów a kontrolą glikemii [10, 33]. Wykazano, że wzrost poziomu HbA1C koreluje ze zwiększoną skłonnością LDL do przechodzenia w formy utlenione [36]. Badania innych autorów nie potwierdziły wpływu wyrównania metabolicznego na poziomy MDA/TBARs, a opisywane rozbieżności mogą wynikać z różnicy długości trwania choroby i/lub wieku badanych [22, 32, 34]. W pracy wykazano IS wyższe stężenie TBARs w grupie dzieci starszych oraz chorujących powyżej cztery lata, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi przez Hsu i wsp. Autorzy wykazali dodatnią korelację stężenia produktów peroksydacji lipidow i oksydacji białek z długością choroby i wyrównaniem metabolicznym [37]. Wpływu czasu trwania DM1 na stężenie TBARS nie potwierdzili
Varvarovska i wsp., a wieku pacjentów badania Martin-Gallan i wsp. [32, 38]. Wcześniejsze doniesienia tych badaczy są odmienne. Czynnikami wpływającymi na proces peroksydacji lipidów i zwiększoną produkcją MDA są także nieprawidłowe stężenia lipidów oraz wskaźnik BMI. Autorzy obserwowali wyższe stężenie MDA u pacjentów z hiperlipidemią oraz z otyłością [39, 17]. W pracy stwierdzono IS wyższe stężenie TBARs w grupie pacjentów, u których wskaźnik BMI był ≥ 90, a poziom cholesterolu ≥ 200 mg%. Wykazane w pracy korelacje pomiędzy TBARs a HbA1C, wiekiem badanych i czasem trwania choroby nasuwają pytanie: czy wzrost stężenia TBARs zależy od nieprawidłowej kontroli metabolicznej czy jest wynikiem długości trwania cukrzycy lub starszego wieku badanych pacjentów. Celem ustalenia tych zależności posłużono się analizą wielokrotnej regresji, która wykazała, że HbA1C była niezależnym czynnikiem wpływającym na stężenie TBARs. Wyniki te są zgodne z wynikami badań innych autorów, którzy wykazali, że niewystarczająca kontrola glikemii, dyslipidemia i/lub nadwaga odpowiadają za nadmierną produkcję TBARs [23, 29]. Najczęściej oznaczanym biochemicznym parametrem oceniającym oksydacyjne uszkodzenia białek są grupy karbonylowe, dinitrotyrozyna, sulfoksyd metioniny (MetSO) i N-formylokinurenina (NFK). Tworzenie końcowych produktów oksydacji białek (AOPP) jest stosunkowo nowym markerem oksydacyjnego uszkodzenia białek. Metoda oznaczania AOPP została po raz pierwszy opisana przez Witko-Sarsat i wsp. [26]. AOPP w zakresie biologicznej aktywności i stymulowania odpowiedzi zapalnej oraz uwalniania cytokin wykazuje pewne podobieństwa z końcowymi produktami glikacji białek (AGE) [40, 41]. Końcowe produkty oksydacji białek są uważane za wczesny marker miażdżycy, jak również czynnik prognostyczny chorób sercowo-naczyniowych [42, 43].
Badania dotyczące powstawania AOPP w DM1 są ograniczone, a prezentowane wyniki rozbieżne. Niektórzy autorzy obserwują nasilone tworzenie AOPP [10, 44, 45], inni natomiast nie znajdują istotnej różnicy w stężeniu AOPP u pacjentów z DM1 w porównaniu z grupą kontrolną [16, 41]. Wyniki własne wskazują na znaczącą kumulację AOPP w DM1. Istotnie wyższe stężenie AOPP stwierdzono w cukrzycy źle kontrolowanej i dłużej trwającej. W dostępnej literaturze brak jest doniesień dotyczących korelacji AOPP z wykładnikami wyrównania metabolicznego cukrzycy. Kalousova i wsp. [44] stwierdzają IS korelację pomiędzy kumulacją AOPP i AGEs, natomiast badania Martin-Gallan
i wsp. wykazały korelację AOPP z obecnością późnych powikłań cukrzycy [45]. W monitorowaniu leczenia chorych na cukrzycę powszechnie wykorzystuje się największą frakcję hemoglobiny glikowanej – izoformę HbA1C. W pracy wykazano dodatnią korelację pomiędzy stężeniem HbA1C a wiekiem pacjentów i czasem trwania choroby, co jest zgodne z wynikami innych autorów [31].
Dodatnia korelacja TBARs i AOPP z czynnikami ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego w cukrzycy może zwiększać możliwość uznania tego markera jako dobrego predyktora powikłań sercowo-naczyniowych, ale dla potwierdzenia tej tezy konieczne jest przeprowadzenie szeroko zakrojonych badań prospektywnych. W pracy w celu określenia diagnostycznej przydatności markerów stresu oksydacyjnego (AOPP, TBARs) zastosowano metodę statystyczną, określaną mianem ROC analizy. Metoda ta pozwoliła na ocenę markera jako potencjalnego wskaźnika obecności choroby oraz jego przydatności do oceny wyrównania metabolicznego cukrzycy. Za pomocą ROC analizy wykazano, że pomimo dodatniej korelacji pomiędzy stężeniem TBARs a poziomem HbA1C oznaczanie jego jako markera kontroli wyrównania metabolicznego u dzieci i młodzieży z DM1 nie może być rekomendowane. Poziom TBARs nie może być też wskaźnikiem obecności choroby. Odmienną wartość diagnostyczną przedstawia poziom AOPP, który wydaje się dobrym wskaźnikiem obecności choroby. Prawdopodobieństwo obecności choroby u osoby, u której stężenie AOPP przekraczało optymalną wartość progową, jest pięciokrotnie wyższe niż u osoby z wynikiem poniżej tej wartości. Pomimo współistnienia dodatniej korelacji pomiędzy AOPP i HbA1C wynik AOPP nie jest dobrym markerem oceniającym monitorowanie metaboliczne cukrzycy. W pracy wykazono wyższe stężenia markerów stresu oksydacyjnego u rodzeństwa pacjentów z DM1. Matteucci i wsp. sugerują, że stres oksydacyjny może wyprzedzać ujawnienie się cukrzycy, czego dowodem jest zaburzony status antyoksydacyjny u krewnych I° pacjentów z DM1.
Według badaczy przyczyną tych zaburzeń może być upośledzenie erytrocytarnego systemu redoks, nasilającego oksydację, zamiast przed nią chronić, a konsekwencją jest generowanie ogólnego tła prooksydacyjnego [46]. Niektórzy autorzy sugerują, że markery stresu oksydacyjnego mogłyby być wskaźnikami rodzinnej podatności na cukrzycę [34, 47]. W prezentowanej pracy stężenia AOPP u rodzeństwa chorych na DM1 były wyższe. Również w ROC analizie znacznie częściej wartości AOPP w grupie rodzeństwa przekraczały wartość progową w porównaniu z grupą kontrolną. Należy podkreślić, że w dotępnej literaturze liczba publikacji dotyczących oceny aktywności markerów stresu oksyadacyjnego u osób z DM1 oraz krewnych I° pacjentów z DM1 jest zbyt mała. Wyższe wartości TBARs u rodzeństwa dzieci z DM1 uzyskane zostały również przez Varvarovską i wsp. [34]. Analizując wzajemne powiązania markerów stresu oksydacyjnego wykazano IS dodatnią korelację pomiędzy stężeniami AOPP i TBARs u dzieci z DM1 oraz tendencję do dodatniej korelacji pomiędzy wymienionymi parametrami w grupie rodzeństwa. Podsumowując, u dzieci we wczesnym stadium DM1, której nie towarzyszą powikłania naczyniowe, wyższe stężenia AOPP i TBARs świadczą o wpływie samej choroby na nasilenie stresu oksydacyjnego. Stwierdzenie istotnie większej kumulacji AOPP i TBARs w grupie chorych ze złym wyrównaniem metabolicznym wskazuje na zależność nasilenia uszkodzeń oksydacyjnych i kontroli metabolicznej cukrzycy.
Wnioski
1. W DM1 obserwuje się nasilony proces peroksydacji lipidów, a jego stopień jest podwyższony u osób z złą kontrolą metaboliczną. 2. U pacjentów z DM1, niezależnie od stopnia wyrównania metabolicznego, wzrasta kumulacja końcowych produktów oksydacji białek, a proces nasila się wraz z czasem trwania choroby. 3. Poza cukrzycą na zaburzony status antyoksydacyjny mogą wpływać inne czynniki, za czym przemawiają wyniki badań u rodzeństwa pacjentów z DM1.
Piśmiennictwo
1. American Diabetes Association; Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus; Diabetes Care 2005:28, 37-42
2. Knip M., Veijola R., Virtanen S.M. et al.; Environmental triggers and determinants of type 1 diabetes; Diabetes 2005:54, 125-136
3. Green K., Brand M.D., Murphy M.P.; Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes; Diabetes 2004:53, 110-118
4. Ho E., Bray T.M.; Antioxidants, NFkappaB activation and diabetogenesis; PSEBM 1999:31, 205-213
5. Bartosz G.; Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie; Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2004
6. Shukla N., Maher J., Masters J.; Does oxidative stress change ceruloplasmin from a protective to a vasculopathic factor?; Atherosclerosis 2006:187, 238-250
7. Valko M., Morris H., Cronin M.T.D.; Metals, toxity and oxidative stres; Curr. Med. Chem. 2005:12, 1161-1208
8. Gutteridge J.; Lipid peroxydation and antioxidants as biomarkers of tissue damage; Clin. Chem. 1995:41, 1819-1828
9. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al.; Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease; Int. J. Bioch. Cell Biol. 2007:39, 44-84
10. Gil-del Valle L., Milian L.C., Toledo A. et al.; Altered redox status in patients with diabetes mellitus type 1; Pharmacol. Res. 2005:51, 375-380
11. Holmgren A.; Antioxidant function of thioredoxin and glutaredoxin systems; Antioxid. Redox Signal 2000:2, 811-820
12. Nordberg J., Arner E.S.J.; Reactive oxygen species, antioxidants and the mammalian thioredoxin system; Free Radic. Biol. Med. 2001:31, 1287-1312
13. Granot E., Kohen R.; Oxidative stress in childhood – in health and disease states; Clinical Nutrition 2004:23, 3-11
14. Dalle-Donne I., Rossi R., Colombo R. et al.; Biomarkers of oxidative damage in human disease; Clin. Chem. 2006:52, 601-623
15. Davison G.W., George L., Jackson S.K. et al.; Exercise, free radicals, and lipid peroxidation in type 1 diabetes mellitus; Free Radic. Biol. Med. 2002:33, 1543-1551
16. Gleisner A., Martinez L., Pino R. et al.; Oxidative stress markers in plasma and urine of prepubertal patients with type 1 diabetes mellitus; J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 2006:19, 995-1000
17. Prazny M., Skrha J., Hilgertova J.; Plasma malondialdehyde and obesity: is there a relationship?; Clin. Chem. Lab. Med. 1999:37, 1129-1130
18. Slatter D.A., Bolton C.H., Bailey A.J.; The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus; Diabetologia 2000:43, 550-557
19. West I.C.; Radicals and oxidative stress in diabetes; Diab. Med. 2000:17, 171-180
20. Galle J., Hansen-Hagge T., Wanner C. et al.; Impact of oxidized low density lipoprotein on vascular cells; Atherosclerosis 2006:185, 219-226
21. Haidara M.A., Yassin H.Z., Rateb M. et al.; Role of oxidative stress in development of cardiovascular complications in diabetes mellitus; Curr. Vasc. Pharmacol. 2006:4, 215-27
22. Telci A., Cakatay U., Salman S. et al.; Oxidative protein damage in early stage Type 1 diabetic patients; Diab. Res. Clin. Pract. 2000:50, 213-223
23. Lipiński B.; Pathophysiology of oxidative stress in diabetes mellitus; J. Diab. Compl. 2001:15, 203-210
24. Tuvemo T., Gebre-Medhin M.; The role of trace elements in juvenile diabetes mellitus; Pediatrician 1985:12, 213-219
25. Thompson D.R., Obarzanek E., Franko D.F. et al.; Childhood Overweight and Cardiovascular Disease Risk Factors: The National Heart, Lung, and Blood Institute Growth and Health Study; J. Pediatr. 2007:150, 18-25
26. Witko-Sarsat V., Friedlander M., Capeillere-Blandin C. et al.; Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia; Kidney Int. 1996:49, 1304-1313
27. Rice-Evans C.A., Diplock A.T., Symons M.C.R.; Techniques in free radical research; Amsterdam, Elsevier Sci Publ. BV 1991
28. Brownlee M.; The pathobiology of diabetic complication. A unifying mechanism; Diabetes 2005:54, 1615-1626
29. Baynes J.W., Thorpe S.R.; Role of oxidative stress in diabetic complications; Diabetes 1999:48, 1-9
30. Schwab K.O., Doerfer J., Hecker W. et al.; Initiative of the German Working Group for Pediatric Diabetology. Spectrum and prevalence of atherogenic risk factors in 27,358 children, adolescents, and young adults with type 1 diabetes: cross-sectional data from the German diabetes documentation and quality management system (DPV); Diabetes Care 2006 Feb:29, 218-225
31. Sibal L., Law H.N., Gebbie J. et al.; Predicting the development of macrovascular disease in people with type 1 diabetes: A 9-year follow-up study; Ann. N Y Acad. Sci. 2006 Nov:1084, 191-207
32. Martin-Gallan P., Carrascosa A., Gussinye M. et al.; Estimation of lipoperoxidative damage and antioxidant status in diabetic children: relationship with individual antioxidants; Free Radic. Res. 2005:39, 933-942
33. Seckin D., Ilhan N., Erdogan S.; Glycaemic control, markers of endothelial cell activation and oxidative stress in children with type 1 diabetes mellitus; Diab. Res. Clin. Pract. 2006:73, 191-197
34. Varvarovska J., Racek J., Stozicky F. et al.; Parameters of oxidative stress in children with type 1 diabetes mellitus and their relatives; J. of Diab. and its Compl. 2003:17, 7-10
35. Vander Jagt D.J., Harrison J.M., Ratliff D.M. et al.; Oxidative stress indices in IDDM subjects with and without long-term diabetic complications; Clin. Biochem. 2001:34, 265-270
36. Hussein O.A., Gefen Y., Zidan J.M. et al.; LDL oxidation is associated with increased blood hemoglobin A1c levels in diabetic patients; Clin. Chim. Acta 2007:377, 114-118
37. Hsu W.T., Tsai L.Y., Lin S.K. et al.; Effects of diabetes duration and glycemic control on free radicals in children with type 1 diabetes mellitus; Ann. Clin. Lab. Sci. 2006:36, 174-178
38. Varvarovska J., Racek J., Stetina R. et al.; Aspects of oxidative stress in children with type 1 diabetes mellitus; Biomedicine and Pharmacotherapy 2004:58, 539-554
39. Erciyas F., Taneli F., Arslan B. et al.; Glycemic control, oxidative stress, and lipid profile in children with type 1 diabetes mellitus ; Arch. Med. Res. 2004:35, 134-140
40. Ahmed N., Babaei-Jadidi R., Howell S.K. et al.; Degradation products of proteins damaged by glycation, oxidation and nitration in clinical type 1 diabetes; Diabetologia 2005:48, 1590-1603
41. Kalousova M., Zima T., Tesar V. et al.; Advanced glycoxidation end products in chronic diseases-clinical chemistry and genetic background; Mutat. Res. 2005:579, 37-46
42. Kaneda H., Taguchi J., Ogasawara K. et al.; Increased level of advanced oxidation protein products in patients with coronary artery disease; Atherosclerosis 2002
43. Descamps-Latscha B., Witko-Sarsat V., Nguyen-Khoa T. et al.; Advanced oxidation protein products as risk factors for atherosclerotic cardiovascular events in nondiabetic predialysis patients; Am. J. Kidney Dis. 2005:45, 39-47
44. Kalousova M., Skrha J., Zima T.; Advanced glycation end-products and advanced oxidation protein products in patients with diabetes mellitus; Physiol. Res. 2002:51, 597-604
45. Martin-Gallan P., Carrascosa A., Gussinye M.; Biomarkers of diabetes-associated oxidative stress and antioxidant status in young diabetic patients with or witout subclinical complications; Free Radic. Res. 2003:34, 1563-1574
46. Matteucci E., Giampietro O.; Building a bridge between clinical and basic research: the phenotypic elements of familial predisposition to type 1 diabetes; Curr. Med. Chem. 2007:14, 555-567
47. Matteucci E., Malvaldi G., Fagnani F. et al.; Redox status and immune function in type I diabetes families; Clin. Exp. Immunol. 2004:136, 549-554
